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PCR应该注意的事项
发布时间:2019-03-12   点击次数:227次

出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现,其原因:是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成聚体。是Mg2+离子浓度过、退火温度过低,及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量,往往些来源的酶易出现非特异条带而另来源的酶 则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另来源的酶。降低引物量,适当增加模板量,减少循环次 数。适当提退火温度或采用温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)。
 
出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差,dNTP浓度过,Mg2+浓度过,退火温度过低,循环次数过多引起。其对策有:减少酶量,或调换另来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量,减少循环次数。
 
克隆PCR产物1)克隆PCR产物的条件是什么?
摩尔数比1:8或8:1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶,插入片段共10ul。室温保温1小时,或4℃过夜。在这2种温度下,缺T-凸出端的载体会自连,产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求,为提连接效率,需4℃过夜。
 
2)PCR产物是否需要用凝胶纯化?
如凝胶分析扩增产物只有条带,不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带,可能是积累了大量引物的聚体。少量的引物聚体的摩尔数也很,这会产生比例的带有引物聚体的克隆,而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。
 
3)如果没有回收到目的片段,还需要作什么对照实验?
A)涂布未转化的感受态细胞。
如有菌落,表明氨苄失效,或污染上带有氨苄抗型的质粒,或产生氨苄抗型的菌落。
B)转化完整质粒,计算菌落生长数,测定转化效率。
例如,将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后,用100ul铺板。培养过夜,产生1000个菌落。转化率为: 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。
铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA,用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA,用1/10铺板,共用1 ng DNA。转化率为:
1000克隆X10(3次方) ng /铺板1 ng DNA ug=10(6次方)cfu/ ug
转化pGEM-T应用10(8次方)cfu/ ug感受态细胞
如没有菌落或少有菌落,感受态细胞的转化率太低。
C)如用pGEM-T正对照,或PCR产物,产生>20-40蓝斑(用指定步骤10(8次方)cfu/ ug感受态细胞),表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶(M1801,M1804,M1794)质量标准好无核酸酶污染,不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。
D)用pGEM-T或pGEM-T Easy载体,连接pGEM-T正对照,转化频率感受态细胞(10(8次方)cfu/ug),按照指定的实验步骤,可得100个菌落,其中60%应为白斑,如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落,连接有问题。
 
4)对照实验结果好,却没有回收到目的片段,实验出了什么问题?
A)连接用室温保温1小时,能满足大多数克隆,为提效率,需4℃过夜。
B)插入片段带有污染,使3`-T缺失,或抑制连接,抑制转化。为此,将插入片段和pGEM-T正对照混合,再连接。如降低了对照的菌落数,插入片段需纯化,或重新制备。如产生大量的蓝斑,插入片段污染有核酸酶,使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。
C)插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段,因受UV过度照射,时有发生。UV过度照射会产生嘧啶聚体,不利于连接,DNA必需重新纯化。
D)带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A,后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料(TM042)。
E)度重复序列可能会不稳定,在扩增中产生缺失和重排,如发现插入片段频率地产生缺失和重排,需用重组缺陷大肠杆菌菌株,如SURE细胞

 

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